嘉靖十四年（1535）进士，授翰林编修。后擢左论德、监察御史，奉旨宣谕诸军。

因得罪严嵩，使仕途坎坷，一度被皇帝认为“漫无区画”而下诏入狱。

后又谪贬为荔波典史。后因拒绝严嵩的推举被人弹劾，再次落官。

隆庆初，赵贞吉成为皇帝的老师，隆庆三年完成了从帝师到阁臣的重大转变，他被穆宗任命为文渊阁大学士参预机务，又在首辅李春芳的支持下，掌管了都察院，迎来了他政治生涯的高峰。

后他在一系列问题上与兵部尚书霍冀发生冲突。其中赵贞吉两次威胁要辞官归乡，但都被皇帝挽留，一次加文肃公为太子太保，一次则罢免了霍冀的官。

文肃公第三次据理力争的时候失败了，在这次政治斗争中，赵贞吉再次用退休来逼迫皇帝，并在奏疏上斥责高拱：“久专大权，广树众党。”而此次皇帝同意了文肃公的退休。

赵贞吉在北京任职时，曾建有宅邸，内有亭台楼阁，俗称“赵家楼”，民国初为曹汝霖宅邸，于五四运动时付之一炬，史称“火烧赵家楼”事件。